Establecimiento de nicotiana benthamiana y arabidopsis thaliana como modelos para optimizar cultivos de células vegetales en biorreactores

[SPA] El cultivo de tejidos vegetales, desarrollado en los años 1920, es una tecnología clave para la transformación genética, la embriogénesis somática, la clonación y la producción de biomoléculas de alto valor. Sin embargo, los mecanismos genéticos y moleculares que regulan el desarrollo y crecimiento del callo aún se comprenden poco. En este trabajo se aplicaron dos estrategias complementarias para mejorar el crecimiento celular vegetal: un enfoque genético con Arabidopsis thaliana para identificar mutaciones que mejoran las propiedades del callo y un enfoque de bioprocesos para optimizar cultivos de Nicotiana benthamiana en biorreactores. Se desarrolló un cribado genético directo que combina visión artificial, inteligencia artificial y análisis estadístico para detectar mutantes T-DNA de A. thaliana 1 con mayor tasa de crecimiento del callo. Se identificaron 190 mutantes, muchos en genes relacionados con el control transcripcional y la regulación hormonal. No todos mostraron un crecimiento vegetativo mayor, lo que confirma la especificidad del cribado basado en callos. Este estudio constituye el primer cribado genético a gran escala enfocado en mutaciones que afectan la tasa de crecimiento del callo. La friabilidad, es decir, la capacidad del callo para formar cultivos líquidos homogéneos es un rasgo importante pero poco caracterizado. Para explorar su base genética, se utilizó un enfoque inverso con datos transcriptómicos que comparaban callos de alta y baja friabilidad. Se analizaron 114 mutantes T-DNA de A. thaliana, identificándose siete con friabilidad reducida y ocho con mayor friabilidad. El análisis microscópico permitió evaluar la agregación celular y validar dos genes asociados a una friabilidad mejorada, demostrando que este rasgo es genéticamente controlable y mejorable. El rendimiento en biorreactores depende también de parámetros como temperatura, oxígeno disuelto (DO), pH y agitación. Usando N. benthamiana como modelo, se implementó una estrategia de control en cascada que combinó aireación y agitación para mantener niveles adecuados de DO, reduciendo el tiempo de cultivo de 21 a nueve días y logrando el escalado mediante criterios de ingeniería convencionales. Durante los cultivos se observaron oscilaciones de pH con una periodicidad de 21 horas. Los ajustes de pH y del tampón afectaron significativamente el crecimiento y la viabilidad. Los análisis transcriptómicos revelaron un reloj circadiano activo y una sincronización parcial del ciclo celular, demostrando que las células vegetales se comportan como un tejido líquido. Este trabajo aporta la primera evidencia de que los cambios en el pH apoplástico están regulados por el ritmo circadiano y coordinados con el ciclo celular.[ENG] Plant cell tissue culture, developed in the 1920s, has become a cornerstone technology for plant genetic transformation, somatic embryogenesis, vegetative cloning, and the production of high-value biomolecules. Despite decades of research, the genetic and molecular mechanisms governing callus development and growth remain poorly understood. In this work, two complementary strategies were employed to improve plant cell growth: a genetic approach using Arabidopsis thaliana to identify mutations enhancing callus properties, and a bioprocess approach to optimize Nicotiana benthamiana cultures in bioreactors. A forward genetic screen combining artificial vision, artificial intelligence, and statistical analysis was developed to identify A. thaliana T-DNA insertion mutants 1 with increased callus growth rates. A total of 190 mutants were identified, many affecting genes related to transcriptional control and phytohormone regulation. Interestingly, not all mutants exhibited enhanced vegetative growth, indicating the specificity of the callus-based screening approach. This constitutes the first large-scale genetic screen targeting mutations that influence callus growth rate. Callus friability, the ability of callus cells to form homogeneous liquid cultures, is a key but poorly characterized trait in plant biotechnology. To uncover its genetic basis, a reverse genetic approach was applied using transcriptomic data comparing high and low friability calli. A total of 114 A. thaliana T-DNA mutants corresponding to differentially expressed genes were screened, revealing seven mutants with reduced friability and eight with increased friability. Microscopic analysis enabled objective evaluation of cell aggregation, leading to the validation of two genes associated with enhanced friability. These results demonstrate that friability is a genetically controlled and improvable trait. While genetic factors are crucial for growth optimization, culture performance in bioreactors also depends on process parameters such as temperature, dissolved oxygen (DO), pH, and agitation. Using N. benthamiana as a model, we implemented a cascade control strategy combining aeration and agitation to maintain DO levels. This reduced culture time from 21 to nine days, with successful scale-up from laboratory to pilot-scale bioreactors using conventional engineering criteria (volumetric mass transfer coefficient, Reynolds number, and geometry). Unexpectedly, pH oscillations with a 21-hour periodicity were observed during culture. Buffering and initial pH adjustments significantly affected growth and viability. Transcriptomic analyses revealed a persistent circadian clock and partial synchronization of the cell cycle, demonstrating that plant cells behave as a liquid tissue. This work provides the first evidence that apoplastic pH changes are circadian-regulated and coordinated with the cell cycle.

Author

• Verdú Navarro, Fuensanta

• Cultivo de tejidos vegetales
• Crecimiento del callo
• Mutantes T-DNA
• Biorreactores

Identifier

hdl:10317/21462

OAI identifier oai:identifier

oai:repositorio.upct.es:10317/21462