Universität Tübingen
Chip-Kalorimetrie zur zeitaufgelösten Untersuchung von mitochondrialen Stoffwechselaktivitäten
Abstract
Die isotherme Kalorimetrie ist eine Methode zur Untersuchung von chemischen Reaktionen in homogener Phase, die ohne den Einsatz von Markierungen auskommt. Die Reaktionswärme sorgt dabei für geringe Temperaturänderungen in einer Messzelle, welche über eine Thermosäule mit einer Wärmesenke in Kontakt steht. Durch die Temperaturdifferenz zwischen Zelle und Senke wird an der Thermosäule eine Spannung generiert, die in einem gewissen Temperaturbereich proportional zur Temperaturdifferenz ist. Die Signale stellen sich auf Werte ein, die proportional zur Wärmeleistung sind. Im Fall der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) ist es beispielsweise möglich, zwischenmolekulare Wechselwirkungen zu charakterisieren. Um detektierbare Signale zu erhalten, ist es allerdings nötig, ausreichend große Wärmemengen zu generieren. Um dies zu erreichen, muss meist eine relativ große Menge der Stoffe eingesetzt werden, die in einem großen Volumen gelöst werden müssen, um ausreichend geringe Konzentrationen zu erzielen. Im Gegensatz dazu wurde in dieser Arbeit ein von Herrn Dr. Lerchner an der TU Freiberg entwickeltes, miniaturisiertes Gerät genutzt. Dieses hat ein Zellvolumen von nur 20 µl, sodass es auf Reaktionen ausgelegt ist, bei denen eine hohe Wärmeleistung pro Volumen vorliegt. Dies ist beispielsweise bei Untersuchungen des Stoffwechsels von Mikroorganismen gegeben. Da aufgrund des geringen Probenvolumens die Wärmekapazität gering ist, liegen die Zeitkonstanten im Bereich von wenigen zehn Sekunden. Gegenüber gängigen ITC Aufbauten, bei denen die Zeitkonstanten typischerweise im Bereich von Minuten liegen, kann die Kinetik der Reaktionen in dem miniaturisierten Aufbau besser erfasst werden. Die vorliegende Arbeit widmet sich der Etablierung von Testverfahren zur Quantifizierung des Stoffwechsels von Hefemitochondrien, sowie Methoden zur Datenprozessierung zur weiteren Verbesserung der zeitlichen Auflösung. Bisher wurden diese Reaktionen vor allem elektrochemisch über den Verbrauch von Sauerstoff verfolgt. Kalorimetrische Verfahren haben den Vorteil, dass auch sauerstoffunabhängige Reaktionen beobachtet werden können. Dies ist insbesondere wichtig für Untersuchungen anderer Mikroorganismen, da beispielsweise viele interessante Bakterien ausschließlich anaeroben Stoffwechsel betreiben. Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) stellen ein interessantes Modellsystem für das Verständnis dieser Zellorganellen dar. Da der Organismus nur auf wenige der Funktionen seiner Mitochondrien tatsächlich angewiesen ist, können Hefen in der Regel selbst mit schwerwiegenden Mutationen in mitochondrialen Genen überleben, bei deren Anwesenheit die Zellen anderer Organismen zugrundegehen würden. Viele mitochondriale Gene sind in S. cerevisiae und im Menschen homolog zueinander, einigen davon wird eine Schlüsselrolle in diversen Krankheiten zugeschrieben. Da das Genom von S. cerevisiae gut charakterisiert ist und viele Techniken zu Genmanipulation gut etabliert sind, handelt es sich um einen besonders interessanten Modellorganismus für ein grundlegendes Verständnis diverser Genfunktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. Rapaport, Herrn Tan und Herrn Dr. Papic ein Messverfahren etabliert, mit dessen Hilfe der Energiestoffwechsel von Mitochondrien zeitaufgelöst beobachtet werden kann. Dieses Verfahren wurde genutzt, um zwei Mutationen in Genen für mitochondriale Proteine hinsichtlich ihres Effekts auf den Energiestoffwechsel zu untersuchen. Die Ergebnisse sind auf Stoffwechselreaktionen von Mikroorganismen übertragbar und können als Grundlage für diverse Untersuchungen dienen. Denkbar sind beispielsweise Studien zur Wirkung antimikrobieller Substanzen oder zur Ausbildung, Wachstum und Resistenzbildung von Biofilmen.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
-
- Le Blanc, Alexander Fabian
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/52929