Universität Tübingen
Funktionelle Auswirkungen Epilepsie-assoziierter Kaliumkanalmutationen
Abstract
Die spannungsabhängigen Kaliumkanäle KV7.2 und KV7.3 generieren den M-Strom in Nervenzellen und sind an der Regulation von Aktionspotentialen beteiligt. Mutationen in diesen Kanälen können einen Funktionsverlust verursachen, was zu reduzierten M-Strömen und erhöhter Erregbarkeit von Nervenzellen führt und neurologische Krankheiten auslösen kann. Die Untersuchung von Auswirkungen der Mutationen auf Struktur und Funktion des Kanals ist von großer Bedeutung für das Verständnis von Pathomechanismen und der gezielten Entwicklung pharmakologischer Reagenzien zum Entgegenwirken der Effekte. Dabei ist es wünschenswert, möglichst physiologische und Patienten-ähnliche Analysebedingungen zu schaffen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Struktur-Funktions-Korrelation eines in vielen KV-Kanälen hoch konservierten Threonin-Restes aufgeklärt und der Effekt eines Austauschs der Aminosäure in KV7.2 und KV7.3 auf die Funktion des Kanals hin untersucht. Der Austausch bewirkt eine Verschiebung der Aktivierungskurve zu depolarisierteren Potentialen mit verlangsamter Aktivierung und beschleunigter Deaktivierung, was eine Präferenz des Kanals zum geschlossenen Konformationszustand impliziert. Dem Thr-Rest wird eine wichtige Rolle für die Stabilisierung des Kanals durch Verbindung des S1-S2-Bereiches mit der S5-Porenregion zugeteilt. Im zweiten Teil wurde durch Expression Epilepsie-assoziierter KV7.2-Mutationen mittels lentiviraler Transduktion von heterozygoten KCNQ2-K.O.-Mauskulturen ein neues System zur Untersuchung von Ionenkanalmutionen entwickelt. Die elektrophysiologische Analyse der krankheitsverursachenden KV7.2 – Kanalmutationen R207Q und N258S konnte in Einzelzellableitungen und auf Multielektroden-Arrays (MEAs) im Netzwerk veränderte Ströme und Feuerungsverhalten nachweisen, was auf übererregbare Zellen und erhöhte Aktivität hinweist und damit die Entstehung der neurologischen Symptome erklären kann. Die Expressionsanalyse konnte fluoreszenzmikroskopisch und im Western Blot einen Trafficking-Defekt mit dominant-negativem Effekt der N258S-Mutation in Neuronen nachweisen. In der Einzelzell-Patch-Clamp Analyse der R207Q-Mutation in Neuronen konnte erstmals über einfache Transduktion / Transfektion die Auswirkung einer KV7.2-Mutation auf das Feuerungsverhalten untersucht werden. Der reduzierte M-Strom und die spätere Aktivierung der Kanäle mit Mutation wirken sich bei stärkeren Reizen mit längeren AP-Folgen durch eine leicht erhöhte Feuerungsrate bzw. übererregbare Zellen aus. Die Analyse des Netzwerk-Feuerungsverhaltens auf MEAs ergab für heterozygote Kulturen, die zusätzlich WT-Kanäle exprimieren, im Vergleich zu Kulturen, die entweder mit mutierten Kanälen oder nur GFP transduziert sind, eine niedrigere Feuerungsrate sowie niedrigere Netzwerk-Synchronizität. Dies zeigt eine höhere Ausprägung epileptischer Eigenschaften für Neurone mit verminderter Anzahl oder defekten KV7.2-Kanälen.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
-
- Füll, Yvonne
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/49938