Universität Tübingen
cAMP- und cGMP-bindende Tandem-GAF-Domänen: Biochemische Untersuchungen mit einer cyanobakteriellen Adenylatcyclase
Abstract
Die Kristallstruktur der CyaB2 GAF-Domänen ist ein antiparalleles Dimer, das cAMP an GAF A und B gebunden hat. Mit einer Chimäre aus CyaB2-GAF-Domänen und CyaB1 Adenylatcyclase (AC) wurde gezeigt, dass beide GAF-Domänen an der Aktivierung beteiligt sind. Im Vergleich zu anderen GAF-Domänen besitzt CyaB2 als zusätzliches Strukturelement einen 14 (GAF A) bzw. 19 (GAF B) AS langen Einschub zwischen K und F in einem konservierten NKFDE-Motiv. Diese Einschübe sind für eine starke positive Kooperativität der allosterischen Aktivierung durch cAMP verantwortlich. Auch machen sie eine kanonische Salzbrücke zwischen K und D im NKFDE-Motiv entbehrlich. Die Bedeutung des NKFDE-Motivs wurde durch entsprechende D/A-Mutationen in verkürzten Konstrukten nachgewiesen. Dies läßt vermuten, dass es sich bei CyaB2 um eine evolutionäre Zwischenstufe zu den Säuger-Tandem-GAF-Domänen handelt. Der Austausch der CyaB1 gegen die humanen PDE5-Tandem-GAF-Domänen erzeugte eine cGMP-stimulierte AC. Überraschenderweise verhinderten D und/oder K-Mutanten im NKFDE-Motiv in einer oder beiden GAF-Domänen der PDE5 die cGMP-Aktivierung nicht, aber sie erniedrigten die Affinität für cGMP 10- bis 23-fach. Mutationen nur in GAF B erhöhten den Aktivierbarkeitsfaktor, vielleicht ein Indiz dafür, dass GAF B entweder die Bindung von cGMP an GAF A oder die Signalübertragung zum katalytischen Zentrum hemmt. Die Entfernung von 147 N-terminalen Resten erhöhte die Basalaktivität stark, senkte den Aktivierbarkeitsfaktor und reduzierte die EC50 für cGMP. Damit scheint der N-Terminus längenabhängig an der cGMP-Bindung und der Aktivierung der katalytischen Domäne beteiligt zu sein.Untersuchungen zur Nucleotidspezifität der GAF-Domänen wurden mit Chimären aus CyaB1 und Ratten-PDE2 durchgeführt. Die Bereiche wurden gemäß der PDE2-Kristallstruktur ausgewählt. Ein Austausch von EL bis EIRIP erzeugte eine gleichermaßen cAMP- und cGMP-stimulierbare AC. Die Mutation von T258S und L259V schaltete die Aktivierung durch cAMP unter Erhalt der cGMP-Aktiverung weitgehend ab. Damit komme ich zu dem Schluß, dass die Nukleotidspezifität in Tandem-GAF-Domänen nicht durch einzelne AS vermittelt wird sondern wahrscheinlich der Effekt eines ganzen Bereiches sind, der noch im Detail zu untersuchen ist.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
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- Bruder, Sandra
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/48878