Universität Tübingen
Modulation der Insulinsignalübertragung durch Proteinkinase C-katalysierte Phosphorylierung von Serin 318 im Insulinrezeptor-Substrat-1
Abstract
Diabetes mellitus Typ 2 ist heute die am weitesten verbreitete Krankheit in der westlichen Welt, doch über die Ursachen weiss man noch sehr wenig. Genetische Defekte führen im Zusammenspiel mit Umwelteinflüssen und der Regulation durch posttranslationale Modifikationen auf Proteinebene über die Insulinresistenz zu Diabetes mellitus Typ 2. Die Rolle posttranslationaler Modifikationen bei der Entstehung der Insulinresistenz ist nur zu einem geringen Teil aufgeklärt. Doch zum Verständnis dieser Krankheit und als Ansatzpunkt für denkbare pharmakologische Therapien ist es notwendig, die molekularbiologischen Ursachen aufzuklären. Die Erforschung der Modulation der Insulinsignalweiterleitung durch Serin- und Threoninkinasen-vermittelte Phosphorylierungen an Insulinrezeptor-Substrat-1 (IRS-1) ist ein Schlüssel zur Aufklärung der zugrundeliegenden Pathomechanismen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass IRS-1 ein Substrat der Proteinkinase (PKC)-zeta ist. Die resultierende Ser-/Thr-Phosphorylierung von IRS-1 reguliert die Insulinsignalweiterleitung unter hyperinsulinämischen Bedingungen. Zur Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser feed-back-Regulation wurde im Rahmen dieser Arbeit ein in vitro-Phosphorylierungssystem entwickelt, um bakteriell exprimierte GST-Fusionsproteine von IRS-1 durch PKC-Isoformen zu phosphorylieren. Detektion der Phosphorylierung erfolgte durch eine neu entwickelte alkalische Negativionen Scan Technik. Die Sequenzierung der Phosphopeptide wurde mit Hilfe einer Ionenfalle durchgeführt. Im Fusionsprotein GST-IRS-1 N2 (Aminosäurensequenz 265-522 der cDNA von IRS-1) wurden Ser318 und Ser436 als in vitro-Phosphorylierungsstellen der PKC-Isoenzyme zeta, delta und beta I gefunden. Mit einem Q-TOF Ultima Massenspektrometer konnten Serin24, Threonin295, Serin787, Serin790, Threonin846, Serin1083 und Threonin1102 als weitere PKC-spezifische in vitro-Phosphorylierungsstellen von IRS-1 identifiziert werden. Die Überprüfung der biologischen Relevanz wurde in Babyhamster Nierenzellen mit stabil transfiziertem Insulinrezeptor durchgeführt. Insulin, ein Aktivator der PKC-zeta hemmt die durch den Insulinrezeptor katalysierte Tyrosinphosphorylierung von IRS-1 und die Wechselwirkung zwischen dem Insulinrezeptor und IRS-1. Diese negative Modulation wird aufgehoben, wenn in IRS-1 Serin318 zu Alanin318 mutiert wird und eine Phosphorylierung an dieser Position nicht mehr möglich ist. Dadurch wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Serin318 in IRS-1 der verantwortliche Aminosäurerest für die beschriebene negative Regulation der Insulinsignalweiterleitung durch PKC-zeta ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung an IRS-1 Ser318 einen hemmenden Effekt auf Erk2 und PKB ausübt. Dadurch könnte die Phosphorylierung an IRS-1 Serin318 durch PKC-zeta sowohl eine Modulation der Regulation der Genexpression und des Zellwachstums, als auch der Protein- und Glykogensynthese und des Glukosetransports bewirken. Serin318 wurde als erste PKC-katalysierte Phosphorylierungsstelle von IRS-1 detektiert, funktionell charakterisiert und die Regulation mit Hilfe eines selbst hergestellten polyklonalen Antikörpers nachgewiesen. Somit konnten im Rahmen dieser Arbeit erste wichtige Grundlagen zum Verständnis der PKC-vermittelten zellulären Insulinresistenz durch Phosphorylierung von IRS-1 geleistet werden.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
-
- Möschel, Klaus
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/48556