Universität Tübingen
Entwicklung von massenspektrometrischen und chromatographischen Mikro-Methoden zur Analyse von Proteinphosphorylierungen
Abstract
Es wurden massenspektrometrische und chromatographische Mikro-Methoden zur Analyse von Proteinphosphorylierungen entwickelt und im Bereich der Insulin- Signaltransduktion angewendet. Zunächst wurden Proteom-analytische Methoden (im Gel-Verdau, Proteinidentifizierung) entwickelt, untersucht und zur Analyse der b- UE des HIR eingesetzt. Zur Aufreinigung und Konzentration von Peptiden und Phosphopeptiden wurden neue RP- sowie IMAC-Mikro-Tip-Techniken entwickelt. Desweiteren wurden die Phosphopeptid-spezifischen Neutralverlust- und Vorläuferionen-Scantechniken (Triple-Quad-MS) untersucht und verglichen. Zur Lokalisierung von Phosphorylierungsstellen wurde zudem die NanoES-MS2 untersucht und ein neues MS3-Verfahren (API- und q2-CID) vorgestellt. Die Scantechniken wurden zur Identifizierung der Phosphorylierungen von b-Casein (< 5 pmol) eingesetzt. Zur effizienten Analyse von Phosphopeptiden wurden off- und on-line-µIMAC/ES-MS-Verfahren entwickelt. Desweiteren wurde eine Phosphopeptid-spezifisches alkalisches µLC/ESI-API-CID-Hybrid-Scan-Verfahren entwickelt und zur Analyse von b-Casein eingesetzt. Mit Hilfe der LC- und MS-Verfahren wurden schließlich Phosphoproteine aus dem Bereich der Insulin- Signaltransduktion analysiert. Mittels [32P]-RP-HPLC-Phosphopeptid-Mapping konnte gezeigt werden, dass 'in vivo' Ser1177/78/82 des HIR für die Autophosphorylierung des Rezeptors entbehrlich, für die Substratphosphorylierung aber notwendig sind. Mittels m/z 79-Vorläuferionen-Analyse konnten die Phosphorylierungen der b-UE des 'in vivo'-insulinstimulierten HIR-WT detektiert werden. Die 'in vitro'-Substratspezifität von PKC-Subtypen wurde mittels on-line- UV-µLC/ESI-MS semiquantitativ untersucht. Mit einem neu entwickelten [32P]-2-D-RP-HPLC/Mikro-ESI/MS-Verfahren und off-line-NanoES-Ionenfallen-MS3 wurde das 'in vitro' mit PKC-bI und -z umgesetzte GST-IRS-1Nk-Fusionsprotein analysiert und eine Phosphorylierung an Ser318 (IRS-1-Sequenz) ermittelt.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
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- Beck, Alexander
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/48440