Universität Tübingen
Aufbau, Charakterisierung und Optimierung eines homogenen Fluoroimmunoassays für die Affinitätsanalytik in Nanolitervolumina
Abstract
Im Bereich der Umweltanalytik gewinnen immunologische Testverfahren zunehmend an Bedeutung. Typische Testvolumina konventioneller Mikrotiterplattentechniken betragen 50-250 µl. Für kosteneffiziente Anwendungen mit hohem Probendurchsatz müssen die Volumina in den Submikroliterbereich verringert werden. Hier sind Waschschritte, wie sie in herkömmlichen Immunoassays erforderlich sind, nicht mehr praktikabel. In diesem Zusammenhang wird für beispielhafte Umweltschadstoffe (Pestizide) ein homogener Fluoroimmunoassay entwickelt, welcher auf Resonanz-Energie-Transfer-Effekten (RET) basiert. Der RET findet zwischen einem Fluorophor (Donor) und einem absorbierenden Molekül (Akzeptor) statt, sofern sich das Emissionsspektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappen. Die Transfer-Effizienz ist stark abstandsabhängig (reziprok zur sechsten Potenz des Donor-Akzeptor-Abstandes), so daß ein homogener Assay etabliert werden kann. Für diesen Assay werden mikrostrukturierte Probenträger (Nanotiterplatten [NTP]) im Format von etwa 2x2 cm^2 mit Kavitäten zwischen 50 nl und 70 nl Volumen verwendet. Für die Probenhandhabung kommen piezoelektrische Dosiersysteme zum Einsatz, die sich zur präzisen Dosierung von Flüssigkeiten (± 1) im (Sub)-Nanoliterbereich eignen. Um die Verdunstung des Wasseranteils zu vermeiden, werden die NTP mit Hilfe von Peltierelementen bis kurz vor den Taupunkt gekühlt. Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt mit einem experimentell aufgebauten NTP-Leser. Hier wird ein Laserstrahl über einen 2D-Scanner auf die NTP gelenkt und so Punkt für Punkt sehr schnell abgetastet. Mittels eines Photomultipliers wird die laserinduzierte Fluoreszenz der Proben gemessen. Aufgrund der geringen Hintergrundfluoreszenz und wegen der guten Verfügbarkeit von preiswerten Lichtquellen wurden zwei langwellige Fluorophore Cy5 (Donor) und Cy5.5 (Akzeptor) ausgewählt. Die Antikörper wurden mit Cy5 markiert, während die Analytderivate über Rinderserum Albumin als Träge
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
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- Schobel, Uwe
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/48076