Universität Tübingen
Untersuchungen zur Aktivität und Spezifität der rekombinanten humanen Arylsulfatase A mit Hilfe der analytischen Isotachophorese
Abstract
Die metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine lysosomale Speicherkrankheit, die durch den Funktionsverlust des Enzyms Arylsulfatase A verursacht wird und zur Anreicherung von 3-Sulfo-Galactocerebrosid (Sulfatid) in den Geweben, insbesondere in Oligodendrozyten und Schwann-Zellen, führt. Als Therapie der MLD wird neben der Stammzelltransplantation versuchsweise auch die Enzymersatztherapie mit der rekombinanten humanen Arylsulfatase A (rhASA) eingesetzt. Aufgabe dieser Arbeit war es, die Aktivität und Spezifität der rhASA mit Hilfe der analytischen Isotachophorese (ITP) zu untersuchen und mit derjenigen von Sulfatasen in Leukozytenextrakten, die mittels Dextransedimentation gewonnen wurden, zu vergleichen. Dazu wurden zuerst Untersuchungen zum Abbau des künstlichen Substrats p-Nitrocatecholsulfat (pNCS) durch rhASA unter verschiedenen Inkubationsbedingungen mit Hilfe der Photometrie, einem Standardverfahren zur Diagnose von Speicherkrankheiten, durchgeführt und danach der Abbau von Sulfatid durch rhASA anhand der Dünnschichtchromatographie nachgewiesen. Schliesslich wurde der Umsatz verschiedener Substrate durch rhASA und Leukozytenextrakte mit Hilfe der ITP miteinander verglichen und so die Spezifität der rhASA untersucht. Mit Hilfe der ITP wurde der Umsatz der 3 Substrate pNCS, Ascorbylsulfat und Galactose-6-sulfat durch rhASA und Leukozytenextrakte untersucht. Mit dieser Methode konnte nachgewiesen werden, dass pNCS und Ascorbylsulfat sowohl durch rhASA als auch durch Leukozytenextrakte, Galactose-6-sulfat jedoch nur durch Leukozytenextrakte abgebaut wird, was darauf zurückzuführen ist, dass Galactose-6-sulfat kein Substrat der Arylsulfatase A ist, von anderen Sulfatasen, die in den Leukozytenextrakten vorhanden sind, jedoch sehr wohl umgesetzt wird. Die ITP erlaubt also durch die Auswahl geeigneter Substrate (Sulfate) die Charakterisierung der Aktivität verschiedener Sulfatasen und kann so z.B. durch Verwendung der oben angeführten Substrate in einem einzigen Analysenlauf eine Differenzierung zwischen metachromatischer Leukodystrophie (MLD) und multiplem Sulfatase-Mangel (MSD) ermöglichen, da mit ihr der Abbau mehrerer Substrate simultan verfolgt werden kann.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
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- Pajarola, Sandra Maria
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/45833