Universität Tübingen
Die Auswirkung von Hypoxie auf die intestinale Tight Junction: Rolle des Transkriptionsfaktors Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1)
Abstract
EINFÜHRUNG: Entzündliche Reaktionen des Darmtraktes führen, durch gestörte Perfusion und gesteigerten metabolischen Umsatz, zur Entstehung einer intestinalen Sauerstoffschuld. Dies führt zu einer Schwächung der epithelialen Barriere, was den Übertritt luminaler Xenobiotika begünstigt. Daraus kann die unkontrollierte Stimulation des intestinalen Immunsystems durch systemische Effekte luminaler proinflammatorischer Moleküle wie Lipopolysaccharid (LPS) resultieren, was in der Entstehung eines systemischen inflammatorischen Response-Syndroms (SIRS) sowie Multiorganversagen (MOF) münden kann. Studien unserer Arbeitsgruppe charakterisierten Hypoxie dabei als kritischen pathogenetischen Faktor des Barriereversagens. Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die noch zu großen Teilen unverstandenen Mechanismen hypoxischer Barriereschwächung mit einem molekularen Korrelat in Verbindung zu bringen und die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen zu identifizieren. Dabei konzentrierten wir uns auf die Tight Junction (TJ), welche hauptsächlich die Durchlässigkeit des epithelialen Zellverbandes reguliert. Im Zusammenhang damit betrachteten wir genauer die hypoxische Regulation der Proteine Zonula occludens 1 bis 3 (ZO-1 bis -3), welche als Verbindungsproteine zwischen Barrierekontakt und Zytoskelett eine wichtige organisierende Einheit der TJ darstellen. ERGEBNISSE & METHODEN: Hypoxie bewirkte einen Anstieg der parazellulären Permeabilität sowie eine gesteigerte Translokation bakterieller Bestandteile in vivo, was wir anhand von Permeabilitäts-Assays (FITC-Dextran resp. Limulus Amebocyte Lysate) in einem murinen Ganzkörper-Hypoxiemodell zeigen konnten. Im Zusammenhang damit stellten wir erstmals mittels Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie die dramatische Desorganisation der tight-junktionalen Architektur unter Hypoxie in vitro dar. Diese Beobachtung korrelierte mit einer Herunterregulation der Proteine ZO-1 bis -3 in vitro und in vivo sowohl auf transkriptioneller (Real-time PCR) als auch translationaler (Western Blot) Ebene. Dabei lieferte die Auswertung der Literatur insbesondere für ZO-1 eindeutige Hinweise auf dessen permeabilitätsbeeinflussenden Effekt. Daran anknüpfend belegte die immunhistochemische Färbung gegen ZO-1 dessen gezielte Entfernung von der TJ unter Hypoxie. Die anschließende softwaregestützte Promoteranalyse (Gene2Promoter, MatInspector; Genomatix-Software) zeigte eine Reihe möglicher Bindungsstellen für O2-sensible Transkriptionsfaktoren – vor allem auch für HIF-1. Eine Herunterregulation von ZO-1 in HIF-1-überexprimierenden Zellen (lentiviraler Gentransfer; Messung mittels Luciferase-Assay) bot deutliche Hinweise auf die regulative Beteiligung des Transkriptionsfaktors. Die darauf folgende Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-Assay) bewies die Bindung von HIF-1 an den ZO-1 Promoter. Eine anschliessende Punktmutation der vermuteten Bindungssequenz ergab, dass der Transkriptionsfaktor nicht mit der zuvor ermittelten HIF-1 Bindungsstelle interagiert, sondern sehr wahrscheinlich mit einer Aryl-hydrocarbon receptor repressor Sequenz (AHRR), welche sich ebenfalls im untersuchten Promotersegment befand. FAZIT: Unsere Ergebnisse zeigen, dass Hypoxie eine Steigerung der intestinalen parazellulären Permeabilität bewirkt. Dieser Beobachtung liegen Veränderungen der tight-junktionalen Architektur zugrunde. Hierbei nimmt die hypoxische Herunterregulation von ZO-1 eine wichtige Rolle ein, welche sehr wahrscheinlich durch HIF-1 vermittelt wird. Zusammenfassend betrachtet tragen diese Ergebnisse zu einem besseren Verständnis pathophysiologischer Vorgänge an der TJ bei. Dies ist für die Entwicklung therapeutischer Strategien essentiell, welche ein Barriereversagen mit unkontrolliertem Antigenübertritt bei kritisch Kranken verhindern sollen.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
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- Born, Christian Philipp
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/45822