Universität Tübingen
Entwicklung und Evaluierung von PCR-Methoden zum Nachweis vom Coccidioides posadsaii
Abstract
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer molekularbiologischen Methode zum spezifischen Nachweis von DNA des dimorphen Pilzes Coccidioides posadasii. Er verursacht die ausschließlich auf dem amerikanischen Kontinent in wüstenartigen Regionen endemische Kokzidioidomykose. Die Diagnostik dieser gelegentlich nach Europa importierten Systemmykose beschränkt sich auf immundiagnostische Tests und die Erregeranzucht. Neben der mäßigen Sensitivität dieser Verfahren ist die Kultur noch dadurch limitiert, dass C. posadasii ausgesprochen infektiös ist und die Anzucht auf Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 beschränkt ist. Grundvoraussetzung für die Entwicklung einer PCR war daher der Nachweis dass die angewandte Methode nicht nur erfolgreich DNA extrahiert sondern auch, dass das Probenmaterial sicher nicht mehr infektiös ist. Es wurden Suspensionen von 10 verschiedenen C. posadasii-Stämmen unter entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen hergestellt und nach einem modifizierten kommerziellen DNA-Extraktionsprotokoll bearbeitet. Zur Zerstörung der Pilzzellwände wurden drei Zyklen bestehend aus Einfrieren in Flüssigstickstoff und Kochen eingefügt. Die parallel bearbeiteten Suspensionen wurden nach jedem Schritt erneut kultiviert, um die Vitalität und damit die Infektiösität nachzuweisen resp. auszuschließen. Pilze waren nur aus unbehandelten Suspensionen wieder anzüchtbar, während alle anderen Kulturen steril blieben. Damit gelang der Nachweis, dass mindestens drei Schritte des Extraktionsprotokolls jeweils alleine bereits ausreichend sicher die Infektiösität der Proben eliminieren. Daraufhin wurde die DNA aus 120 klinischen Isolaten von C. posadasii aus dem Endemiegebiet in Monterrey in Mexiko nach diesem Protokoll extrahiert. Zusätzlich wurden Gewebeproben untersucht, in denen entweder mikroskopisch eine Kokzidioidomykose diagnostiziert oder eine andere Systemmykose identifiziert worden war. Für die in dieser Arbeit entwickelten PCR-Verfahren wurde die Zielsequenz in einem Gen gewählt, welches für das erregerspezifische „antigen 2/proline-rich antigen“ (Ag2/PRA) kodiert. Während das erste PCR Produkt 526 Basenpaare lang ist, weist das nested Produkt 342 Nukleotide auf. Die Hybridisierungssonden des real-time PCR-Verfahrens (LightCycler) sind komplementär zu Nukleotidregionen innerhalb des Nested-PCR Produktes. Mit beiden PCR-Verfahren konnte DNA aus allen 120 Stämmen amplifiziert werden, während das mit DNA aus Stämmen anderer Pilzgattungen nicht gelang. Die Sequenzierung des 526 bp langen Amplifikates der ersten PCR von 35 zufällig ausgewählten Isolaten und die Schmelzkurvenanalyse der Light-Cycler PCR aller 120 Stämme zeigten entweder eine 100% Übereinstimmung mit der Gensequenz von C. posadasii (accession number in GenBank: AF013256) oder eine einzige stumme Mutation ausschließlich in der in der Nukleotidposition 1228 (Guanosin statt Cytosin). Neben der hohe er Spezifität der PCR-Verfahren konnte mittels klonierter Plasmid-DNA auch die Sensitivität des konventionellen PCR-Verfahrens bestimmt werden, die ein Detektionslimit von 1 fg aufwies. Die zwei Spezies der Gattung Coccidioides werden anhand zweier Mikrosatelliten-tragender Gene (GAC und 621.1) unterschieden. Durch die Längenbestimmung beider Mikrosatelliten wurden 117 von 120 in dieser Arbeit untersuchten Isolate als C. posadasii identifiziert. Mit der konventionellen nested-PCR konnte spezifische Coccidioides-DNA aus drei histologisch als Kokzidioidomykose identifizierten Gewebeproben amplifiziert werden, während die DNA aus 20 paraffin-eingebetteten Gewebeproben mit anderen Systemmykosen negativ blieben. Das damit erkennbare diagnostische Potenzial der neu etablierten PCR-Verfahren zum Nachweis von Coccidioides spp. bleibt in Studien anhand klinischer Materialien weiter zu evaluieren.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author
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- Kern, Jan
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier
- hdl:10900/44714