Untersuchungen zur Autophagie bei Trypanosomen unter besonderer Berücksichtigung von autophagierelevanten Proteinen und deren in vivo-Kristallbildung

Die afrikanische Schlafkrankheit ist trotz jahrzehntelanger Bemühungen zur Bekämpfung der Parasiten nach wie vor eine existenzielle Bedrohung für die Menschen und Nutztiere der betroffenen Regionen in Afrika. Aktuell verfügbare Therapiemöglichkeiten basieren auf veralteten Medikamenten, welche eine hohe Toxizität aufweisen und für die betroffene Bevölkerung nicht bezahlbar sind. Neue, effektive und bezahlbare Medikamente sind dringend nötig, auch als Beitrag zur nachhaltigen Verbesserung der sozialen und wirtschaftlichen Bedingungen der betroffenen Menschen. Ein Ansatzpunkt ist der Eingriff in die für das Überleben des Parasiten essentielle Differenzierung während seines Lebenszyklus, bei welcher autophagische Prozesse eine große Rolle spielen. Über die Rolle der Autophagie bei Trypanosomen ist bisher wenig bekannt, aber genomische Untersuchungen legen nahe, dass Trypanosomen eine primitivere Form der Autophagie, verglichen mit den höheren Eukaryonten, aufweisen. Nähere Untersuchungen der beteiligten Proteine können einen notwendigen Beitrag zum Verständnis dieses für den Parasiten kritischen Prozesses darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur von ATG8 aus Trypanosoma brucei (TbATG8), ein wichtiges ubiquitin-ähnliches Markerprotein für autophagische Prozesse, bestimmt. Die Struktur von TbATG8 bildet eine charakteristische Ubiquitin-Faltung aus und zeigt insgesamt eine große Ähnlichkeit zu den bekannten Strukturen der Ubiquitin-like modifier (Ubl) aus höheren Eukaryonten, was darauf hindeutet, dass dieser Teil der Autophagie in struktureller Hinsicht bereits in diesen evolutionsgeschichtlich sehr alten Einzellern konserviert vorliegt. Mit dieser ersten Struktur eines Autophagieproteins aus Protozoen wurden ferner Interaktionsmöglichkeiten mit der zugehörigen Protease TbATG4 untersucht. Auch hier ergab sich, dass eine ähnliche Komplexbildung aus TbATG8 und TbATG4, wie in den höheren Eukaryonten, möglich ist. Dennoch weisen die homologen ATG4-Proteine gegenüber dem humanen ATG4 eine Deletion eines Sequenzbereichs auf, welche für die Entwicklung z.B eines Inhibitors interessant sein kann. Für die Autophagie ebenfalls relevant sind die lysosomalen Proteasen, denen neben der Prozessierung autophagierelevanter Proteine, hauptsächlich beim Abbau des Zellmaterials eine große Bedeutung zukommt. Besonders interessant für die Entwicklung von Inhibitoren ist hier das cathepsin-B like protein aus Trypanosoma brucei (TbCatB), eine Cysteinprotease welche essenziell für das Überleben des Erregers im Blut des Menschen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein zunächst im bakteriellen Expressionsystem E.coli exprimiert, wobei trotz verschiedener Proteinkonstrukte auf diesem Wege nicht ausreichend lösliches rekombinantes Protein gewonnen werden konnte. Daher wurde das Protein anschließend mit dem eukaryotischen Baculovirus-Expressionssystem in SF9-Insektenzellen exprimiert. Bei der Überexpression der Preproform von TbCatB zeigten nadelförmige Mikrostrukturen innerhalb der Insektenzellen, welche im Folgenden als Proteinkristalle identifiziert werden konnten. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte die Morphologie und Lokalisation näher bestimmt werden. Die Kristalle ließen sich in ersten Pilotexperimenten nicht direkt für eine Strukturaufklärung mit Synchrotonstrahlung verwenden und so wurde eine Methode entwickelt, die Kristalle aufzureinigen und zu resolubilisieren. Für das resolubilisierte Protein konnte eine Cathepsin B-Aktivität nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Kristalle das rekombinante TbCatB in zwei Formen unterschiedlicher Glykosylierung enthalten. Enzymatisch deglykosyliertes Protein konnte anschließend erfolgreich für eine Rekristallisierung und Strukturaufklärung eingesetzt werden. Die Struktur von TbCatB zeigt im Vergleich zum humanen Cathepsin B Unterschiede im Bereich der Bindetasche und kann daher verwendet werden, um die Spezifität von Inhibitoren zu verbessern. In einem weiteren Experiment konnte anhand von TbIMPDH gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit untersuchte neue Form intrazellulärer Kristallbildung nicht nur auf ein Protein beschränkt ist, und auch Proteine anderer Funktion und Lokalisierung solche in vivo-Kristalle in Insektenzellen bilden können.

Author

• Koopmann, Rudolf

Identifier

hdl:10900/43930

OAI record oai:identifier

https://publikationen.uni-tuebingen.de/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=mets&identifier=oai%3Apublikationen.uni-tuebingen.de%3A10900%2F43930