Characterization of CNP-induced cGMP signaling in the gastrointestinal tract and its role in colonic smooth muscle relaxation

Hintergrund: Im Gastrointestinaltrakt (GIT) reguliert der Signalweg des cyclischen Guanosin-3‘,5‘-monophosphates (cGMP) die Wasser und Elektrolytsekretion in Epithelzellen, sowie die Relaxation der glatten Muskulatur. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass das C-Typ natriuretische Peptid (CNP), welches cGMP-Bildung durch die Guanylylzyklase B (GC-B) hervorruft, eine Glattmuskelrelaxation im Pylorus und Kolon auslöst. Weiterhin leiden Mäuse mit einer GC-B „loss-of-function“-Mutation unter einer Pylorusstenose und einem aufgeblähten Ileum, Coecum und Kolon. Jedoch sind die Zelltypen, welche diesen Glattmuskel relaxierenden Effekt von CNP sowie den Blähbauchphänotyp auslösen, noch nicht bekannt. Ziel der Arbeit: Das Ziel dieser Arbeit ist es, die CNP- und GC-B-exprimierenden Zellen im GIT zu identifizieren und die Bedeutung der CNP-induzierten cGMP Signaltransduktion für die Kolonmotilität aufzuklären. Material und Methoden: Es wurden globale GC-B Knockout (KO) Mäuse generiert, um potentielle Fehlfunktionen des GITs zu untersuchen. Die Transkription von CNP und GC-B in gastrointestinalen (GI) Segmenten wurde mittels Xgal Färbungen von lacZ Reportermäusen untersucht. Die CNP- und GC-B-transkribierenden Zelltypen wurden mithilfe von Immunfluoreszenz Doppelfärbungen identifiziert und die Expression von GC-B im Western Blot bestätigt. Die CNP-stimulierte Bildung von cGMP konnte, mithilfe von Mäusen die einen cGMP-Biosensor spezifisch in Glattmuskelzellen und Neuronen exprimieren, in vitro untersucht werden. Ferner wurden isometrische Kraftmessungen durchgeführt, um den Einfluss von CNP auf das Kontraktionsmuster von Kolonabschnitten, in der An- und Abwesenheit von Tetrodotoxin, zu untersuchen. Ergebnisse: Bei jungen GC-B KO Mäusen (<P20) wurde ein Blähbauchphänotyp beobachtet, welcher mit dem Ileum, Coecum und Kolon assoziiert war. Eine hohe Anzahl CNP transkribierender Zellen wurde im Oesophagus, Pylorus, Dünndarm und Dickdarm gefunden. GC-B transkribierende Zellen dahingegen, wurden in hoher Anzahl im Oesophagus, Pylorus, Ileum, Dickdarm und den mesenterialen Lymphknoten (MLN) gefunden. Auf Proteinebene konnte die Expression von GC-B im Oesophagus, Pylorus, Ileum, Kolon und den MLN bestätigt werden. Identifiziert wurden folgende Zelltypen: Im Dünndarm transkribierten Paneth Zellen CNP und im MLN transkribierten lymphatische Endothelzellen GC-B. Im Kolon hingegen transkribierten nitrerge Neuronen des adulten enterischen Nervensystems (ENS) beide Gene (CNP und GC-B), während Glattmuskelzellen nur GC-B transkribierten. Die durch CNP stimulierte, intrazelluläre Biosynthese von cGMP, wurde in vitro in beiden Zelltypen gezeigt. In Glattmuskelzellen wurde das dadurch gebildete cGMP durch die Phosphodiesterasen (PDE) 2A und 5 abgebaut. Dosis-Wirkungs-Kurven haben gezeigt, dass die CNP vermittelte Relaxation der glatten Muskulatur des Kolons konzentrationsabhängig ist (EC50 = 15 nM CNP). Bei Konzentrationen von ≥ 50 nM CNP zeigte die glatte Muskulatur des distalen Kolons eine stärkere Reduktion der Kontraktionsamplitude, als die glatte Muskulatur des proximalen Kolons. Interessanterweise führten 100 nM und 250 nM CNP, im distalen Kolon von Wildtyp (WT) Mäusen, zu vollständiger Relaxation der zirkularen glatten Muskulatur, währen dieselben CNP Konzentrationen im distalen Kolon von globalen GC-B KO Mäusen zu keinerlei Reaktion führten. Darüber hinaus relaxierte das distale Kolon von Neuronen-spezifischen GC-B KO Mäusen in gleichem Maße wie das distale Kolon von WT Mäusen. Der Glattmuskelzell-spezifische GC-B KO dahingegen, verhielt sich ähnlich wie der globale GC-B KO, aber signifikant verschieden vom WT. Schlussfolgerung: Im Kolon werden CNP und GC-B von nitrergen Neuronen des adulten ENS transkribiert und GC-B darüber hinaus auch von Glattmuskelzellen. Das von Glattmuskelzellen exprimierte GC-B, aber nicht das GC-B in nitrergen Neuronen, vermittelt den relaxierenden Effekt von CNP auf die zirkuläre Glattmuskelschicht des Kolons. Des Weiteren stimuliert CNP auch die Bildung von cGMP in Glattmuskelzellen des Kolons. Dieses cGMP wird von PDE2A und PDE5 abgebaut. Die Ergebnisse dieser Arbeit implizieren, dass der CNP/GC-B/cGMP Signalweg zur basalen Hemmung der zirkulären Glattmuskelschicht des distalen Kolons beiträgt.

Author

• Krämer, Michael Simon

Identifier

hdl:10900/129012

OAI record oai:identifier

https://publikationen.uni-tuebingen.de/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=mets&identifier=oai%3Apublikationen.uni-tuebingen.de%3A10900%2F129012