Charakterisierung Migräne-relevanter Mutationen anhand Struktur-Funktions-Untersuchungen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit

Die aus drei verschiedenen Untereinheiten (α-, β-, γ-) aufgebaute Na+/K+-ATPase ist ein ubiquitäres Membranprotein, das zu den P-Typ-ATPasen gehört und maßgeblich an der Bildung und Erhaltung des Transmembranpotentials beteiligt ist. Als omnipräsente Ionenpumpe transportiert sie unter Verbrauch eines ATP-Moleküls drei Natrium-Ionen aus der Zelle und im selben Zyklus zwei Kalium-Ionen ins Zellinnere. Durch diesen aktiven Transport wird auch das Ruhepotential in Neuronen aufrechterhalten, das kritisch für die Erregbarkeit ist. Mutationen in der Na+/K+-ATPase α-Untereinheit können wesentliche Proteinfunktionen massiv beeinträchtigen. Von den bisher bekannten vier humanen α Untereinheiten sind die beiden Isoformen α2 und α3 mit neurologischen Erkrankungen assoziiert. Während Mutationen in der Na+/K+-ATPase α3-Untereinheit zu der seltenen Erbkrankheit "Dystonie-Parkinsonismus-Syndrom" führen, kommt es bei genetischen Veränderungen in der α2-Untereinheit zu einer autosomal-dominant vererbbaren Form der Migräne mit Aura, der "Familiären Hemiplegischen Migräne" des Typs II (FHM-2). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss 14 migräne-relevanter Mutationen auf Struktur-Funktions-Beziehungen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit untersucht. Überwiegend handelte es sich hierbei um typische Punktmutationen, wobei auch je eine Deletions- und eine Frameshift-Mutation näher betrachtet wurden. Die Auswahl der ATP1A2-Mutanten erfolgte nach ihrer Lokalisation in funktionell wichtigen bzw. hochkonservierten Regionen der Na+/K+-ATPase α2-Untereinheit. Mit Hilfe des Expressionssystems der Xenopus laevis Oozyten konnten die Konsequenzen der unterschiedlichen Aminosäure-Austausche eingehend charakterisiert werden. Hierfür standen neben elektrophysiologischen auch biochemische und spektroskopische Methoden zur Verfügung. Ausgenommen von zwei ATP1A2-Mutationen konnten die übrigen erfolgreich in der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die beiden Mutationen S966X (Frameshift) und del(K935-S940)insI (Deletion) befinden sich unmittelbar in der Nähe der C-terminal gelegenen Transmembrandomäne TM9 und verursachen starke strukturelle Veränderungen, die dazu führen, dass ein verkürztes und nicht korrekt in die Plasmamembran integrierbares Protein entsteht. Vier weitere FHM2-Mutationen (T263M, G301R, T376M und R937P) wiesen ebenfalls keine stationären Pumpströme auf, trotz ihrer fehlerfreien Integration in die Plasmamembran. Durch die strukturelle Veränderung in den hochkonservierten Regionen ist die Na+/K+-ATPase-Funktion dieser Mutanten schwerwiegend beeinträchtigt. Anhand der Na+/K+-ATPase-Kristallstruktur konnte gezeigt werden, dass hier essentielle Wasserstoffbrücken-Netzwerke destabilisiert werden, die die Transportaktivität massiv beeinträchtigen. Bei acht der untersuchten FHM2-Mutationen ließen sich diverse Parameter, wie Spannungswerte für halbmaximale Ladungsverschiebungen, Wechselzahlen, sowie Na+- und K+-Affinitäten im Detail bestimmen. Nennenswert sind hierbei insbesondere die zwei Mutanten: P979L und X1021R. Die Charakterisierung der P979L-Mutation führte zu der Erkenntnis, dass sie sich funktionell wie das Wildtyp-Enzym verhält und keinerlei Abweichungen aufweist. Allerdings lässt sich diese Beobachtung lediglich bei Xenopus laevis-Oozyten machen, die bei etwa 18°C kultiviert und analysiert werden. In Säugerzellen, die bei einer Temperatur von 37°C wachsen und untersucht werden, zeigte sich, dass die Mutation bei Körpertemperatur offensichtlich zu einem degradierten Protein führt. Durch die FHM2-Mutation X1021R ist der C-Terminus um 28 Aminosäuren elongiert. Elektrophysiologische Messungen ergaben ein vollkommen kontroverses Verhalten des veränderten Proteins gegenüber dem Wildtyp. Die Addition von zusätzlichen Aminosäuren an den C-Terminus führt zu gravierenden Veränderungen in der Natrium-Interaktion und der Spannungssensitivität. Strukturell betrachtet leisten der C-Terminus und die zugehörige Switch-Region einen erheblichen Beitrag zur Bildung der dritten Natrium-Bindungsstelle.

Author dc:creator

• Tavraz, Nedime Neslihan

Advisor dc:contributor.advisor

• Friedrich, Thomas

Licence dc:rights.uri

• http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/

Language dc:language.iso

de, German

Identifier URI

urn:nbn:de:kobv:83-opus-28974
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2677

OAI identifier oai:identifier

oai:depositonce.tu-berlin.de:11303/2974