Biochemische Charakterisierung und physiologische Bedeutung eines neuen durch Typ I Interferon induzierten Gens

In der vorliegenden Arbeit wurden Struktur, Expression und Regulation des Interferon-regulierten-Gens-28 (IFRG28) untersucht und das Protein anhand von selbst hergestellten monoklonalen Antikörpern und stabil-transfizierten Zelllinien biochemisch und funktionell charakterisiert. Als IFN-spezifische Kontrollelemente konnten in der proximalen Promotorregion drei Interferon-Stimulierte-Response-Elemente (ISRE) und mehrere GAS- (Gamma-Aktivierte-Sequenz) Motive identifiziert werden, deren Einfluss auf die Induzierbarkeit des IFRG28-Promotors mit Hilfe von Deletionskonstrukten in Reporergenassays untersucht wurde. Die Analyse ergab, dass die Aktivität der untersuchten Promotorregion in den ISRE begründet liegt. Um den individuellen Einfluss jedes der drei Motive auf die Transkription überprüfen zu können, wurden Punktmutationen in die einzelnen Elemente eingeführt. Die sequentielle Inaktivierung aller drei Motive zeigte, dass jedes ISRE allein funktionell ist, obwohl individuelle Unterschiede in ihrer Aktivität festgestellt wurden. Für die biochemische Charakterisierung wurde das Protein heterolog in Bakterien exprimiert und als aufgereinigtes GST-Fusionsprotein einer Sprague Dawley Ratte zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern injiziert. Nach Zellfusion und anschließendem Screening konnten 18 Hybridome identifiziert werden, von denen 17 ein spezifisches Signal im Western-Blot und in der Immunpräzipitation zeigten. Mit Hilfe der gewonnen Antikörper konnte nachgewiesen werden, dass IFRG28 sehr schnell durch IFN induziert wird, eine lange biologische Halbwertszeit von mehr als 8 h besitzt und sehr wahrscheinlich in vesikukären Strukturen lokalisiert ist. Zur Aufklärung einer möglichen Funktion wurden Zelllinien mit stabiler IFRG28-Expression hergestellt und auf eine veränderte Zellphysiologie nach Transgenexpression untersucht. Es stellte sich heraus, dass IFRG28 die zytopathischen Effekte einer Infektion mit Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) und Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) hinauszögert. Dieser Nachweis konnte an zwei verschiedenen Zelllinien erbracht werden, womit sichergestellt ist, dass die antivirale Aktivität kein Positionseffekt der integrierten DNA darstellt. Um den Zusammenhang einer antiviralen Wirkung mit der IFRG28-Expression näher zu prüfen, wurde die Replikation des EMCV in den konstitutiv exprimierenden Ba/F3 Zellen verfolgt. In diesen Versuchen konnte klar gezeigt werden, dass IFRG28 einen hemmenden Einfluss auf die virale Replikation ausübt.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2005

Author dc:creator

• Klehr, Markus

Contributors dc:contributor

• Zawatzky, Rainer

Repository record source_url

http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/5561

OAI identifier oai:identifier

oai:archiv.ub.uni-heidelberg.de:5561