Antikörper-Fusionsproteine zur Beeinflussung intrazellulärer Vorgänge

Verfahren zur gezielten Beeinflussung intrazellulärer Vorgänge sind heute hauptsächlich auf rekombinante genetische Methoden beschränkt. Diese sind jedoch mit zahlreichen Limitierungen verbunden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte daher eine neue Klasse von makromolekularen Modulatoren mit therapeutischem Potential entwickelt werden. Diese Modulatoren sollten zum einen die Fähigkeit besitzen, spezifisch an ihre Zielzellen zu binden, andererseits aber auch effektiv an ihren intrazellulären Wirkort gelangen können. Erreicht wurde dies durch die Generie-rung modularer Multidomänenproteine, welche sämtliche für ein effizientes intrazelluläres Targeting erforderlichen Funktionen in einer einzigen Polypeptidkette vereinigen. Das als �Ligand Sneaking� bezeichnete Verfahren wurde modellhaft für die Interaktion mit Schlüsselstellen der NF-kappaB-Signalkaskade entwickelt. Ein anti-Transferrinrezeptor single chain Antikörper-fragment (aTFR-scFv) diente dabei der Zielzellerkennung und Internalisierung der Fusions-proteine. Für die Translokation in das Cytoplasma wurde die Endosomen-escape-Domäne des Exotoxins A aus dem Bakterium Pseudomonas aeruginosa verwendet. Verschiedene Peptid-liganden kamen als spezifische Modulatoren für die Interaktion mit der NF-kappaB-Signalkaskade zum Einsatz. Die einzelnen funktionellen Domänen wurden mittels PCR amplifiziert und in den Vektoren pOPE101 bzw. pHOG21 kombiniert. Nach der Expression in E. coli und der affinitäts-chromatographischen Aufreinigung aus periplasmatischen Extrakten konnte die Identität der Fusionsproteine im Western Blot bestätigt werden. In einer ELISA-Bindungsstudie wurde die spezifische Bindung an den Transferrinrezeptor belegt. Mit Hilfe konfokalmikroskopischer Ana-lysen konnte ausserdem gezeigt werden, dass Ligand Sneaking-Fusionsproteine über rezeptor-vermittelte Endozytose von ihren Zielzellen aufgenommen wurden. Die intrazelluläre Verteilung der Proteine wurde in verschiedenen Kolokalisationsexperimenten untersucht. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die interne Translokationsdomäne aus Pseudomonas im Kontext der Fusionsproteine funktionell ist und den Übertritt der Modulatoren in das Cytoplasma vermittelt. Mit Hilfe eines NF-kappaB-Reporter Assays konnte das NF-kappaB-inhibierende Potential der dargestellten Fusionsproteine demonstriert werden. Für einen potentiellen Austausch des Targeting-Antikörpers wurde zusätzlich ein scFv-Fragment gegen das Nierenzellkarzinom-spezifische G250-Tumorantigen aus einer Hybridomzellinie isoliert und charakterisiert. Dieses Antigen wird nach Ligandenbindung internalisiert und stellt somit ein geeignetes Zielmolekül für die Behandlung von Nierenzellkarzinomen im Rahmen eines Ligand Sneaking-Ansatzes dar. Durch seine Universalität bietet das Ligand Sneaking-Prinzip die Chance zur Entwicklung einer völlig neuen Klasse von Therapeutika, die durch ihre hochspezifische Wirkungsweise eine neue Dimension pharmakologischer Selektivität erreichen.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Heidelberg

Year

2004

Author dc:creator

• Broders, Olaf

Contributors dc:contributor

• Dübel, Stefan,

Repository record source_url

http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/4744

OAI identifier oai:identifier

oai:archiv.ub.uni-heidelberg.de:4744