Freie Universität Berlin
Glycan-based biomarkers for the quality assurance in stem cell therapy
Abstract
dc:description.abstractDie Glykokalyx ist eine dichte Schicht an der Zelloberfläche, die sich aus komplexen Kohlenhydratstrukturen zusammensetzt. Qualitative und quantitative Veränderungen des Glykosylierungsmusters der Zelloberfläche können genutzt werden, um bestimmte Stammzellpopulationen zu identifizieren, um die Differenzierungs einer Stammzelle (SZ) zu verfolgen sowie den Verlust des SZ- Status festzustellen, was von großer Bedeutung auf dem Gebiet der regenerativen Medizin sowie des Tissue Engineerings ist. In der vorliegenden Arbeit wurde eine einfache, schnelle, reproduzierbare und sensitive Methode zur Charakterisierung des N-Glykosylierungsprofils der Zelloberfläche etabliert und optimiert. Die häufig genutze Methode zur Analyse der N-Glykosylierung von Zellen besteht aus der Isolierung von Membranglykoproteinen, der einer enzymatischen N-Glykanfreisetzung folgt. Jedoch ist bei Anwendung dieser Methode der Anteil der N-Glykane vom High- Mannose-Typ relativ hoch, wobei diese vorwiegend aus intrazellulären Proteinen des endoplasmatischen Retikulums (ER) stammen können. Für die neu etablierte Methode, die direkt Glykopeptide der Zelloberfläche freisetzt, konnte mittels MALDI-TOF-MS eine Erniedrigung des Anteils an N-Glykanen vom High-Mannose-Typ von 90 % auf 10 % bestätigt werden. Zudem konnte die Sensitivität der Detektion sowie Quantifizierung der N-Glykane vom Komplex-Typ stark verbessert werden. Die Selektivität der neuen Methode wurde am Beispiel der Zelllinien HEK 293, CHO-K1, AGE1.HN und Hep G2 getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die N-Glykosylierung der Zelloberfläche der untersuchten Zelllinien strukturell die Hauptmerkmale der Glykoproteine aufwiesen, welche rekombinant in ihnen produziert werden. Unter Verwendung der neu etablierten Methode, wurde das N-Glykosylierungsmuster der Zelloberfläche von aus Knochenmark isolierten humanen mesenchymalen Stammzellen (MSZn) und den aus ihnen adipogen, chondrogen sowie osteogen differenzierten Zellen mittels MALDI-TOF-MS und CE- LIF untersucht. Darüberhinaus wurden zur Bestätigung der gefundenen Strukturen Exoglykosidaseverdaus des Gesamt-N-Glykanpools sowie Fragmentierungen der N-Glykansignale über MALDI-TOF/TOF-MS Analysen durchgeführt. Analog wurde verfahren, um das N-Glykosylierungsmuster der Zelloberfläche von humanen embryonalen Stammzellen (ESZn) vor und nach ihrer Differenzierung in Hepatozyten-ähnliche Zellen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass das N-Glykom von adipogen differenzierten MSZn im Vergleich zu undifferenzierten MSZn eine deutlich geringere Fucosylierung sowie Antennarität aufweist. Aufgrund eines signifikant erhöhten Anteils werden die N-Glykane H6N5F1 und H7N6F1 als potentielle Glykan-basierte Stammzellmarker für undifferenzierte MSZn sowie H3N4F1 und H5N4F3 für adipogen differenzierte MSZn vorgeschlagen. Das N-Glykosylierungsprofil der Zelloberfläche von chondrogen differenzierten MSZn vor und nach Isolierung aus ihrer extrazellularen Matrix (EZM) wurde untersucht und mit dem Profil undifferenzierter MSZn verglichen. Die Ergebnisse zeigten einen erhöhten Anteil von High-Mannose-Typ Strukturen sowie einen geringeren Anteil von Komplex-Typ N-Glykanen in chondrogen differenzierten MSZn mit EZM. Im Falle des Nichtvorhandenseins der EZM wird die Differenzierung von einem erhöhten Anteil biantennärer N-Glykane begleitet. Im Vergleich zu den undifferenzierten MSZn wies das N-Glykanprofil chondrogen differenzierter MSZn eine geringere Antennarität auf. Es wurden N-Glykane mit Fucosen (Fuc) detektiert, die am N-Acetylglucosamin des reduzierenden Endes der Kernstruktur (core-Fucosylierung) oder an den Antennen gebunden vorlagen (LewisX Epitope). Die triantennären N-Glykane H6N5F1 und S1H6N5F1 sowie tetraantennären Strukturen H7N6F1, S1H7N6F1 und S2H7N6F1 werden als potentielle Glykan-basierte Biomarker für undifferenzierte MSZn vorgeschlagen. Zudem werden die biantennären N-Glykane S1H5N4F2 und S2H5N4F1 als potentielle Glykan-basierte Biomarker für chondrogen differenzierte MSZn vorgeschlagen, die aus ihrer EZM isoliert waren. Die biantennären Strukturen H3N4F1, H4N4F1 und H4N4F2 werden als Glykan-basierte Biomarker für chondrogen differenzierte MSZn mit EZM vorgeschlagen. Die osteogene Differenzierung von MSZn wurde begleitet von einem erhöhten Anteil biantennärer N-Glykane. Zudem war die Antennarität der N-Glykosylierung der Zelloberfläche osteogen differenzierter MSZn geringer. Der Anteil fucosylierter Strukturen war nach der Differenzierung erhöht und bestand hauptsächlich aus core-fucosylierten N-Glykanen. Als potentielle Glykan-basierte Biomarker für osteogen differenzierte MSZn werden die biantennären Strukturen H4N4F2, H5N4, H5N4F1, S1H5N4 und S1H5N4F1 vorgeschlagen. Das N-Glykosylierungsprofil undifferenzierter ESZn und den aus ihnen differenzierten Hepatozyten-ähnlichen Zellen war signifikant unterschiedlich. ESZn enthielten einen höheren Anteil an N-Glykanen vom High-Mannose-Typ wohingegen N-Glykane vom Komplex-Typ, wie zum Beispiel bi- und triantennäre Strukturen, dominant vertreten waren in Hepatozyten-ähnlichen Zellen. Zudem waren in den Hepatozyten-ähnlichen Zellen vollgalactosylierte Strukturen viel häufiger vertreten als in undifferenzierten ESZn. Das GalNAc Epitop konnte als strukturell charakteristisch in Hepatozyten-ähnliche Zellen nachgewiesen werden. Basierend auf den Ergebnissen wurden die High-Mannose-Typ N-Glykane H6-9N2 und die Komplex-Typ N-Glykane H4N4F1 und H3N5F1 als potentielle Glykan-basierte Biomarker für humane ESZn vorgeschlagen. Die biantennären N-Glykane H5N4, H5N4F1, H5N4F2, S1H5N4, S1H5N4F1 und S2H5N4F2 sowie die triantennären Strukturen H6N5F1 und S1H6N5F1 wurden als potentielle Biomarker für Hepatozyten-ähnliche Zellen vorgeschlagen.
Author and committee
dc:creator, dc:contributor.*- Author dc:creator
-
- Montacir, Houda
Subjects
dc:subject × 5Rights
- Licence dc:rights.uri
- Language dc:language
- eng
Identifiers
dc:identifier.*- Identifier URI
- http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8658