Modificações genéticas em linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae para a fermentação de xilose

Para a produção economicamente viável de etanol de segunda geração a partir de bagaço de cana são necessários vários avanços tecnológicos em diferentes etapas deste bioprocesso incluindo o melhoramento genético de microrganismos fermentadores. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais usado para tal por ser uma excelente fermentadora e tolerante aos estresses dos grandes processos fermentativos industriais. Dentre os principais açúcares que compõem o bagaço de cana, destaca-se a xilose, uma pentose que pertence à fração hemicelulósica. Todavia, S. cerevisiae só utiliza hexoses na fermentação, não sendo capaz de metabolizar pentoses. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma levedura capaz de fermentar xilose. Inicialmente, foi feito um estudo das características genéticas da linhagem industrial de S. cerevisiae JP1 – microrganismo hospedeiro selecionado como alvo das modificações desejadas (Capítulo 1). Pode-se verificar que a linhagem JP1 é diploide e heterotálica. Mostrou-se também sensível às principais drogas usadas em processo de seleção de recombinantes assim com uma boa eficiência de transformação. Além disso, foi construída uma linhagem auxotrófica para uracila com a dupla deleção do gene URA3. Posteriormente, a linhagem JP1 foi modificada geneticamente para se tornar capaz de fermentar xilose a etanol (Capítulo 2). Foram construídos cassetes de expressão para duas enzimas da via metabólica de xilose - xilose isomerase e xiluloquinase – clonados em vetor epissomal. A linhagem recombinante obtida foi submetida à adaptação metabólica por 48 dias em meio contendo apenas xilose como fonte de carbono, levando a um aumento na taxa de crescimento de 0,008 h-1para 0,13 h-1. Estudos preliminares de fermentação em meio sintético mostrou um acúmulo de xilitol (YX/S = 0,29 g g-1) e baixa produção de etanol (YE/S = 0,27 g g-1). Para incrementar a produção de etanol, um cassete de deleção para o gene GRE3 (aldose redutase) foi desenvolvido. Além disso, consideramos a introdução de um gene codificador para um transportador com afinidade por xilose, visando aumentar o influxo de xilose para a célula. Para tanto, foi iniciada uma análise transcricional da levedura Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 adaptada ao hidrolisado de bagaço de cana a fim de compreender a regulação em diferentes concentraçõesde xilose e glicose, além de selecionar um possível transportador de xilose para ser expresso em S. cerevisiae (Capítulo 3). Dados preliminares indicam que o gene com maior expressão em xilose foi XYL3 e, dentre os transportadores putativos de xilose, XUT1. Esse trabalho representou uma das primeiras iniciativas no País no emprego de abordagens de engenharia metabólica para o desenvolvimento de um bioprocesso em linhagem industrial de S. cerevisiae. No seu conjunto, nossos resultados preliminares mostram que o desenvolvimento da tecnologia nacional para a produção de álcool lignocelulósico utilizando microrganismos modificados geneticamente é plenamente viável. Embora a linhagem obtida nesse estudo não tenha apresentado rendimentos de etanol desejáveis a partir de xilose, foi demonstrada a eficácia das ferramentas moleculares desenvolvidas que poderão ser empregada em futuros estudos. Além disso, comprovamos que as características genéticas da linhagem industrial JP1 a tornam uma interessante plataforma para futuras modificações relacionadas a outros bioprocessos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Author dc:creator

• Reis, Viviane Castelo Branco

Advisor dc:contributor.advisor

• Torres, Fernando Araripe Gonçalves

Statement dc:rights

• Acesso Aberto

Language dc:language.iso

Português

Repository record dc:identifier.uri

http://repositorio.unb.br/handle/10482/13119

OAI record oai:identifier

http://repositorio2.unb.br/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=dim&identifier=oai%3Arepositorio.unb.br%3A10482%2F13119