Funktion und Einfluss der nicht-repetitiven, terminalen Domänen auf Speicherung und Assemblierung von Spinnenseidenproteinen

Weibliche Radnetzspinnen sind in der Lage bis zu sechs verschiedene Spinnenseidenfasern mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften herzustellen, die denen von syntheti-schen Hochleistungsfasern wie Kevlar oder Hochleistungsstahl zum Teil überlegen sind. Die am besten untersuchte Spinnenseide ist diejenige, die für die Speichen, den Rahmen sowie als Abseilfaden verwendet wird. Sie wird als dragline-Seide bezeichnet und ist hauptsächlich aus zwei Proteinklassen aufgebaut, die als MaSp1 und MaSp2(Major Ampullate Spidroin) bezeichnet werden. Die mehrere hundert Kilodalton großen Spidroine bestehen im Wesentlichen aus einer repetitiven, strukturell ungeordneten Kerndomäne, die von relativ kleinen, ca. 100-140 Aminosäuren langen nicht-repetitiven, globulären Domänen flankiert ist. Das Hauptunterscheidungsmerkmal zwischen MaSp1 und 2 ist der Prolingehalt der repetitiven Sequenzen wobei in MaSp2 viel (>10%) und MaSp1 (<0,4%) wenig Proline enthalten sind. In der dragline Seide der Gartenkreuzspinne Araneus diadematus sind zwei Spidroine, genannt ADF3 und 4, mit einem hohen Prolingehalt identifiziert wor-den, die beide deshalb zur Klasse der MaSp2-Proteine gehören. Die nicht-repetitiven terminalen Domänen sind globulär gefaltet und die Sequenzen sind über verschiedene Sei-denarten und Spezies stark konserviert. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der nicht-repetitiven amino- (NTD) und carboxyterminalen (CTD) Domänen auf das Lösungs- und Assemblierungsverhalten von rekombinanten Spinnenseidenproteinen auf Basis von ADF3 und 4 zu untersuchen. Der Fokus lag dabei zunächst auf der carboxyterminalen Domäne NR3 des Spinnenseidenproteins ADF3 aus A. diadematus. Die Struktur der Domäne wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Franz Hagn (AG Kessler – TU München) mit Hilfe von NMR gelöst. Es bildet in Lösung ein parallel orientiertes, mittels Disulfidbrücke kovalent verknüpftes Dimer aus, zu dessen Struktur bisher keine Homologen bekannt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die NR3-Domäne in Lösung die Bildung von sphärischen mizellartigen Assemblaten vermittelt, wie sie auch im natürlichen Spinntrakt beobachtet wurden. Eine weitere wichtige Rolle konnte bei der scherkraftinduzierten Assemblierung beobachtet werden, wo nur eADF3-Proteine mit der NR3-Domäne in der Lage sind ausgerichtete Faserbündel auszubilden. In einem weiteren Projektteil wurde die Interaktion zwischen rekombinanten Varianten von ADF3 und 4 untersucht, da beide Proteine mit hoher Wahrscheinlichkeit auch in der Spinne in den gleichen Zellen produziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass durch Co-Expression der entsprechenden Gene von eADF3-NR3 und eADF4-NR4 in E. coli ein NR3-NR4 vermitteltes Heterodimer entsteht. Dieses Heterodimer besitzt eine vergleichbare strukturelle Integrität wie die entsprechenden Homodimere. Das durch Phosphationen induzierte Assemblierungsverhalten des Heterodimers unterscheidet sich signifikant von dem der Homodimere. Während eADF3-NR3 sphärische Assemblate bildet und eADF4-NR4 mehrere hundert Nanometer lange Fibrillen, wie sie in ähnlicher Form in den natürlichen Fasern beobachtet wurden, lagert sich das Heterodimer zu einem Netzwerk aus im Vergleich dünneren und weniger langen Fibrillen zusammen. Diese Entdeckung ist unter Umständen wichtig für das Verständnis des natürlichen Spinnprozesses. Aus biotechnologischer Sicht stellt die quantitative Verknüpfung von Spinnenseidenproteinen mit unter-schiedlichen Eigenschaften über die carboxyterminalen Domänen einen interessanten Ansatz zur Generierung von neuen Materialien mit einstellbaren Eigenschaften dar. Letztendlich wurden rekombinante eADF3 Spinnenseidenproteine, die sowohl amino- als auch carboxyterminale Domänen aufwiesen, näher charakterisiert. Die isolierte aminoterminale Domäne bildet bei Senkung des pH-Wertes von 7 auf 6 ein antiparalleles Dimer aus. Es konnte gezeigt werden, dass NTD-eADF3-Proteine, die nur die aminoterminale Domäne N1 enthielten, ebenfalls pH-abhängig Dimere bilden. Bei eADF3-Proteinen mit beiden terminalen Domänen, die per se als CTD-vermitteltes kovalentes Dimer vorliegen, ist die Ausbildung eines aminoterminal vermittelten intermolekularen Dimers-vom-Dimer hingegen nur schwach ausgebildet. Weitere Experimente deuten jedoch darauf hin, dass die NTD in einem intramolekularen Dimer vorliegen. Die Ergebnisse zeigen, dass die CTD einen starken Einfluss auf die Ausrichtung der repetitiven Kerndomäne hat und somit auch die NTD vermittelte intermolekulare Dimerisierung beeinflussen kann. Die Erkenntnisse wurden verwendet um ein Modell über die molekularen Abläufe während des Spinnprozesses zu erstellen, dass sowohl die Speicherung der Proteine als auch die Assemblierung mit einschließt.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2013

Author dc:creator

• Eisoldt, Lukas

Contributors dc:contributor

• Scheibel, Thomas

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/100/

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